?
注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
鹽酸萘替芬（標(biāo)準(zhǔn)品）基甲酸甲酯

碳酸鈣（標(biāo)準(zhǔn)品）氨基-6-溴吡啶

甲磺酸氨地平（標(biāo)準(zhǔn)品）氨基-溴吡啶

伏格列波糖（標(biāo)準(zhǔn)品）5-溴-氨基吡啶

琥珀酸甲潑尼龍（標(biāo)準(zhǔn)品）一頻吶酮

六甲蜜（標(biāo)準(zhǔn)品）N-芴甲氧羰基-N'-*基-D-組氨酸

甲氧普（標(biāo)準(zhǔn)品）Boc-氨甲基哌啶

阿魏酸哌（標(biāo)準(zhǔn)品）吩噁

哌（標(biāo)準(zhǔn)品）三水合三化

奧扎格雷鈉（標(biāo)準(zhǔn)品）(1R,2S)-1-氨基-2-茚

TG100-115肌氨酸叔丁酯鹽酸鹽

鹽酸地芬尼多（標(biāo)準(zhǔn)品）2,二硫酚

鹽酸烏拉地爾6-甲氧基-1-茚酮

鹽酸烏拉地爾（標(biāo)準(zhǔn)品）鹽酸非那吡啶

鹽酸氟桂利（標(biāo)準(zhǔn)品）2,3,6-三氟

鹽酸氟桂利2-氨基-6--硝基吡啶

異喹啉物（標(biāo)準(zhǔn)品）2-氨基并噻唑

羥酯（對羥基甲酸酯）（標(biāo)準(zhǔn)品）甲基-5-(beta-羥基)噻唑

載脂蛋白A1Phospho-EGFR(Tyr1086) /FITC  熒光素標(biāo)記兔抗、大、表皮生長因子受體IgG300 ul

自噬相關(guān)蛋白16APhospho-EGFR(Tyr1148) /FITC  熒光素標(biāo)記兔抗、大、表皮生長因子受體IgG100 ul

酸化自噬相關(guān)蛋白4DPhospho-EGFR(Tyr1173) /FITC  熒光素標(biāo)記兔抗、大、表皮生長因子受體IgG100 ul

酸化自噬相關(guān)蛋白4CPhospho-EGFR(Tyr845) /FITC  熒光素標(biāo)記兔抗、大、表皮生長因子受體IgG100 ul

酸化自噬相關(guān)蛋白7Phospho-EGFR(Tyr998) /FITC  熒光素標(biāo)記兔抗、大、表皮生長因子受體IgG20 ul

酸化自噬相關(guān)蛋白16AEGF(mouse)/FITC  熒光素標(biāo)記表皮生長因子()IgG100 ul

酸化自噬相關(guān)蛋白9AHB-EGF/DTSF/FITC  熒光素標(biāo)記肝素結(jié)合性表皮生長因子IgG100 ul

酸化自噬相關(guān)蛋白4DEGF/FITC  熒光素標(biāo)記表皮生長因子()IgG20 ul

酸化自噬相關(guān)蛋白4DEP3/FITC  熒光素標(biāo)記E受體3IgG100 ul
驢源性成分(Don)核酸試劑盒規(guī)格AGXT2L2蛋白抗體Tombozine中文名：別名：Tombozine分子式：C19H22N2O

β淀粉樣蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白1抗體Rauvoyunine B中文名：別名：分子式：C23H26N2O6

錨蛋白重復(fù)及SAM結(jié)構(gòu)域蛋白6抗體Rauvoyunine A中文名：別名：分子式：C21H28N2O3

二磷酸腺苷核糖基轉(zhuǎn)移酶3抗體N-Feruloyltyramine中文名：N-阿魏酰酪胺別名：Moupinamide; 阿魏酰酪胺分子式：C18H194

二磷酸腺苷核糖基轉(zhuǎn)移酶5抗體11-Methoxyuncarine C中文名：別名：Reserpinine oxindole分子式：C18H194